Agnieszka urodziła się w Gracciano w Toskanii w 1268 r. Pochodziła z bogatej rodziny Segni.

W dziewiątym roku życia wymogła na swoich rodzicach zgodę na wstąpienie do klasztoru w Montepulciano. Dołączyła wtedy do zakonnic, zwanych – ze względu na szorstkie ubranie, które nosiły – „siostrami worka”.

Mając lat 14 prowadziła już życie doskonałej modlitwy, a częstokroć widziano ją, jak podczas niej wznosiła się ponad ziemię. W rok później przyłączyła się do siostr zakładających nowy klasztor w Proceno. Mając zaledwie 15 lat, za dyspensą papieską, chociaż wbrew własnej woli, została przełożoną sióstr w klasztorze w Procena (Viterbo).

Po siedemnastu latach kierowania tym klasztorem, na prośbę mieszkańców swego rodzinnego miasta powróciła do Montepulciano i w 1306 r. założyła klasztor dla ekspiacji na miejscu dawnego domu nierządu. Przyjęła dla tego klasztoru Regułę św. Augustyna, potem uzyskała dla swego klasztoru kierownictwo Zakonu Kaznodziejskiego i zaprowadziła obserwancje według Reguły dominikańskiej.

Pomódl się hymnami do św. Agnieszki

 
Agnieszka znana była z nadzwyczajnych umartwień: przez 15 lat pościła o chlebie i wodzie i spała na gołej ziemi. Zwierzała się, że odczuwa na modlitwie jak gdyby miała rosę w postaci krzyżyków, że czuje się tak dobrze, jak gdyby była otoczona kwiatami i że owa rosa udziela się z jej osoby również i innym.

Wokół jej postaci powstały wdzięczne legendy. Jedna z nich mówi, że rozstając się pewnego razu z Boskim Dzieciątkiem, które nawiedziło ją na rękach swej Matki, zerwała Mu z szyi krzyżyk i zachowała na zawsze, a gdy go jej skradziono, powrócił do niej w cudowny sposób.

Umocniona darami Ducha Świętego, stała się jasną lampą modlitwy i miłości, a dzięki swojemu męstwu oraz autorytetowi podtrzymywała ducha obywateli w dążeniu do jedności i pokoju.

Złożona ciężką chorobą, zmarła 20 kwietnia 1317 roku, w 33. roku życia. Ciało św. Agnieszki pozostawało kompletne i nieskażone do XVI w., kiedy zamurowano je w ścianach głównego ołtarza. Gdy św. Katarzyna Sieneńska, pełna czci dla świętości, wiedzy i pokory Agnieszki, w kilkadziesiąt lat po jej śmierci pragnęła ucałować jej stopy, jedna ze stóp Świętej podniosła się do ust czcicielki i również na św. Katarzynę spłynęła błogosławiona rosa.

Obecnie w sanktuarium św. Agnieszki w Montepulciano znajduje się jej relikwia. Kości, ręce, nogi, stopy i mózg, które zachowały się nietknięte rozkładem, zajmują na modelu, przedstawiającym postać św. Agnieszki, swoje zwykłe miejsce.

Kanonizowana została przez papieża Benedykta XIII w dniu 10 grudnia 1726 roku.